抗体纯化方法沉淀法、Protein A/G亲和层析、离子交换层析

　

概述

制备出效价高，特异性强，稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础，抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败，不同的免疫学实验方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）对抗体的效价，浓度和纯度有不同的要求。我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。下面就一一介绍常用抗体纯化方法及其相关原理。


免疫球蛋白主要有5种，轻链和重链的组成也有较大差异。其结构如下图所示：


各类免疫球蛋白有不同的亚型，下图展示人免疫球蛋白各亚型的理化性质：

沉淀法

硫酸铵/辛酸沉淀法是纯化抗体最传统的方法之一，被广泛用于血清和腹水抗体的浓缩和粗纯，此方法可大规模粗纯抗体，但纯化后纯度不高，还需配合其它方法继续纯化。
通常是将饱和硫酸加入血清或腹水中，将抗体沉淀下来，然后在溶解沉淀继续下一步的纯化。
辛酸沉淀抗体通常要先将腹水或血清的pH调至4.8，然后缓慢的滴加辛酸，是蛋白沉淀，抗体在上清中，上清继续下一步的纯化。

离子交换层析

离子交换层析也常用于抗体的纯化，通量大，工业上用离子交换层析成本低，主要用于除去非抗体蛋白，及用亲和层析纯化时混入的Protein A/G等亲和填料脱离的配基，内毒素的去除等。
离子交换纯化时，根据抗体的pI选择合适的离子交换类型，在pI未知时可以分别用阴阳离子交换填料去试验。
会用到的离子交换填料有：
DEAE/Q/CM/SP/MMA/MMC Focurose 6FF
MMA/MMC Focurose 6FF被广泛用于聚体和单体及内毒素的去除，MMA/MMC是复合型离子交换填料，层析过程洗脱时通常要用改变pH的方式洗脱。

Protein A/G亲和层析

Protein A/G亲和层析为从血清，腹水，细胞培养液中纯化单克隆抗体最快捷的方法，一步层析后纯度可以达到95%左右，不同来源不同亚型的抗体和Protein A/G的亲和力不同。protein A和proteiin G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A和proteinG 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上，当抗血清从中流过时，特异性的IgG就与配基结合，其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同，我们需要具体情况具体对待，分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a,IgG2b,IgG3，兔，人，猪的多克隆抗体用protein A纯化，而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗，小鼠，大鼠，山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。

Protein G与Protein A均可结合抗体的Fc段，不同的是，Protein G还能结合Fab段，且Protein G可以更广泛的结合更多类型的IgG分子，多克隆IgG分子，同时Protein G与血清蛋白结合水平低，产物纯度高，且配基脱落更低。

种类	亚类	Protein A	Protein G
人	IgA	可变	-
	IgD	-	-
	IgE	-	-
	IgG1	++++	++++
	IgG2	++++	++++
	IgG3	-	++++
	IgG4	++++	++++
	IgM	可变	-
豚鼠	IgG1	++++	++
	IgG2	++++	++
仓鼠	/	+	++
小鼠	IgG1	+	++++
	IgG2a	++++	++++
	IgG2b	+++	+++
	IgG3	++	+++
	IgM	可变	-
大鼠	IgG1	-	+
	IgG2a	-	++++
	IgG2b	-	++
	IgG3	+	++
兔	/	++++	+++
禽蛋黄	IgY	-	-
狗	/	++	+
猪	/	+++	+++
马	/	++	++++
牛	/	++	++++
绵羊	/	-/+	++
山羊	/	-	++
猴子	/	++++	++++
骆驼	/	-	+
熊	/	-	+
“-”：不结合 “+”：弱结合 “++”：结合 “+++”：中等结合 “++++”：强结合

表：Protein A和 Protein G与不同种属IgG的结合强度