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样品如何处理其初步提纯,蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?

时间:2020-06-26 21:31 点击次数: 更多 蛋白提取纯化 文章
 

 样品如何处理其初步提纯(如何洗去蛋白的自身带)?

(1)上清样品处理,要加入去污剂,蛋白酶抑制剂,还原剂,还要注意温度及超声破碎的参数。
(2)去大肠杆菌自身带(两条 30KD-40KD)可用非变性缓冲液超声悬浮(加入去垢剂),离心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不够可继续上述步骤)。
(3)大肠杆菌包涵体的洗涤,可用包涵体洗液多洗几遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可选取其中纯度最佳的。
(4)可用硫酸铵沉淀法,初步提纯。

蛋白挂在柱子上洗脱不下来,怎么解决?

(1)洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强) 策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
(2)降低 PH 的方法洗脱的,因为若 PH 低于 3.5,会导致镍离子脱落策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱。
(3)蛋白已沉淀在柱上策略:减少上样量和孵育的时间,试用去污剂(1%-2%Tritonx-100)或改变 NaCl 的浓度,或在变性条件下洗脱(用 8M 脲,或 6M 盐酸胍),最终也可在洗脱 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸钠进行洗脱。
(4)非特异性疏水或其他相互反应策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的浓度。

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