蛋白纯化中HPLC分析检测和分离纯化，反向 HPLC 方法分离的原理

　HPLC 既可以做分析也可以做制备

HPLC 用来纯化，上样量那么小有什么意义？

HPLC 纯化上样量小，这样分离效果好，就可能得到很纯的物质，同时配合质谱等就何以得到很多单一蛋白的特性包括序列等，这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。

HPLC 用来分析检测，怎样指导以后的分离纯化工作呢？

HPLC 重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具.分析出来后如果这个物质很稳定，直接线性放大就可以做大规模的制备，因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。

利用蔬水性质，用反向 HPLC 方法分离的原理？

反相和疏水都是依据物质的极性来纯化的，极性越强先出来，极性越弱越后出，洗脱疏水是高盐吸附低盐洗脱，反像是极性强的流动相吸附，降低它的极性洗脱，选择主要是依据填料的特点以及样品本身的特点而改变的。
疏水的填料疏水集团密度只是反相的 10%左右,其他的都是亲水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基团,因此疏水一般需要高盐吸附,低盐洗脱,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脱是逐渐增加有机溶剂的量.由于以上的原因,疏水比反相要温和,蛋白一般不变性,由于填料多为琼脂糖凝胶,所以蛋白回收率高,而反相适合做分析多,也有做制备的,那也是一些分子量相对小的多肽,反相的回收率也低, 因为硅胶杂吸附的原因.疏水色谱是纯化蛋白的另一个有力的工具.