如何获得纯净的目的蛋白?

蛋白纯化概念

蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。

常用的四大蛋白纯化方法

01亲和纯化色谱
根据蛋白与色谱基质上偶联的特异性配体间的可逆性相互作用分离蛋白。该技术对目的蛋白具有高选择性、高分辨率和高容量。纯化回收率通常较高。
02离子交换色谱
不同蛋白质的等电点（pI, isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
离子交换层析属于吸附性分离方式，纯化过程中它具有可逆、操控性强及实现样品浓缩等特点。在精纯实验中是常与其它方法相结合使用的主要技术。
03分子排阻色谱
又称为凝胶过滤 (Gel Filtration, GF) 色谱。根据分子大小差异对通过树脂的分子进行分离。其目的可以是分离其中一种分子或者分析样品的分子量分布。SEC可提高抗体样品的纯度和均一性。与离子交换或亲和色谱不同，该方法中分子不与色谱介质结合。
04疏水作用色谱（HIC)
*注释：HIC（Hydrophobic Interaction Chromatography）
HIC 根据抗体表面疏水性的差异，利用这些蛋白与介质疏水性表面之间可逆性的相互作用对其进行分离。对色谱柱施加盐浓度从高到低的反梯度。较高的盐浓度可增强样品中疏水组分与色谱介质间的作用。分离过程中，样品得到纯化并以较小的体积洗脱出来，从而实现浓缩，随后可直接进行凝胶过滤或者离子交换分离（经过缓冲液交换后）。HIC 在纯化方案中可用于收集、中间体纯化或精制步骤。

常用纯化方法对比

层析方法	亲和纯化色谱	离子交换色谱	凝胶过滤色谱	疏水作用色谱
分离机制	特异性	所带电荷	分子大小	疏水性
载量	高	高	低	高
纯化速度	高	高	中等	高
生物相容性	好	好	非常好	中等
目的蛋白得率	高	高	高	中等

蛋白纯化中常遇问题及解决方案

问题	解决方案
纯化的蛋白/抗体错误	检查DNA,确认序列是否正确
洗脱的蛋白/抗体有污染需要提高纯度	结合和洗涤条件应更加严格结合和洗涤缓冲液中应含有最高浓度可为20 mM的咪唑 色谱柱太大一减少树脂用量 与标签蛋白相关的污染加入B-ME等还原剂以减少二硫鍵形成
蛋白/抗体沉淀	增加其他纯化步骤,如离子交换色谱 维持低浓度(浓度<1 mg/mL) 维持充分的还原状态(>5 mM DTT),以免氧化 维持高盐浓度(500 mM)并加入甘油(>10%) 加入精氨酸,浓度为50 mM-500 mM 加入温和的非变性去污剂,如0.1%6B-辛基葡糖苷
洗涤步骤中蛋白/抗体洗脱	在温下纯化 降低洗涤缓中液中咪唑浓度
蛋白/抗体洗税不下来	降低洗涤缓冲液的严格度 洗脱条件可能太温和一使用梯度pH值和洗脱缓冲液洗脱,以确定最佳洗脱条件 蛋白可能处于聚集(寡聚体/多聚俐)状态-在变性条件下洗脱 蛋白在色谱柱中沉淀--分批结合井洗脱,以免局部蛋白浓度过高

案例展示