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常用PCR列举及简介

时间:2020-06-09 15:15 点击次数: 更多 pcr技术原理 文章
 常提到的PCR全部在这里:

1、Colony PCR

在蓝白斑筛选时常用到的菌落PCR,用灭菌的牙签挑细菌菌落,放入PCR混合物中,充分混合一般就可以了。标准的做法是将菌落和Mix的混合液在99℃下处理2-5min,离心,取上清1-2μl加入新的Mix中进行PCR反应。但是一般直接反应,就可以扩增出来条带。

2、Degenerate PCR

当研究是从蛋白质出发时,常会用到简并PCR。我们已知蛋白质的氨基酸序列,但是由于密码子的简并性,无法得知准确的DNA序列,这时候就要设计简并PCR引物,可以在扩增过程中保证引物与模板可以配对。而这种PCR就是Degenerate PCR。

3、Error Prone PCR

这种PCR的目的就是为了产生随机突变,用于后续各种目的的研究。正常PCR中用到的DNA聚合酶有聚合和纠错的两种功能。在这种PCR中,采用的聚合酶没有纠错的功能。那么扩增会产生随机突变文库。

4、Hot start PCR

减少因为引物结合在错误的位点而导致的非特异性扩增。首先PCR反应混合物在不加入聚合酶的情况下,95℃加热2min,然后再加入聚合酶,开始反应。这里面常用的是Eubacterial typeⅠ DNA polymerase,Pfu,它在室温下活性很低,要温度大于70℃才有较好的活性。

5、Inverse PCR

用于扩增一段已知序列两侧的未知序列的方法。一段线性的序列,中间的一段是已知的。目前我们PCR都是已知两端,设计引物,扩增中间部分。现在变成了两端未知,那么首先将线性序列自身连接(self ligate),然后再用限制性内切酶处理已知的序列,环状被剪成了线状,同时曾经中间的已知序列也变成了两侧的,可以设计引物,进行正常的PCR扩增。

6、Long PCR

一般PCR扩增的都是1000bp以内或者左右的序列,这个一般扩增5kb,甚至大于10bk长度的序列。用于长序列的克隆,但是效率低,要求反应有更高的准确度,一般采用Pfu酶。

7、Multiplex PCR

需要多对引物,在一个反应里,扩增不同的目的序列,当然最好相似度低一些的,不然很难设计引物区分。

8、Nested PCR

同样为了非特异性扩增。这种PCR需要设计两对引物。第一对引物可以扩增包含了目的基因的较长的一段序列,产物再次用第二对引物扩增,第二对引物扩增区域被包含在第一对引物之间。因为引物有结合在错误位点的可能,所以两种引物大大的降低了这种概率。设计两对引物以达到扩增目的基因的方法还可以用于其他的情况中,以增加扩增效率。

9、Quantitative Real-time PCR (qPCR)

是一种实时检测的荧光定量PCR,非常灵敏。在PCR反应体系中加入荧光基团,通过检测荧光化学物质检测链式反应,和反应总量,实现了实时;通过加入内参或外参或绘制标准曲线可知模板中DNA的量,实现了定量(绝对定量/相对定量)。
常用的荧光方法:
①SYBR Green法,加入该燃料,可以结合在双链DNA的小沟,并释放荧光。它的使用很方便,但是不是特异性的。
②TagMan probe,探针可特异性与模板DNA互补配对,这时探针上的Repoter基团发射的荧光信号一直被Quencher基团吸收。而当PCR进行时,Tag酶外切活性将探针降解,Repoter基团释放荧光信号。这种探针的优点是特异性强,可与Multiplex PCR联用。
③Molecular Beacon probe,与前一个探针类似,都是拥有Reporter基团Quencher基团,增加反应特异性,可以与Multiplex PCR联用。与TagMan结合目的片段不同的是,molecular beacon probe通过Blocker结合在PCR反应的特异性引物上,当反应开始,Tag酶外切,使之释放荧光。大体与前一个探针类似。
qPCR中最重要的概念就是cycle threshold(Ct值-循环阈值)了,每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

10、Reverse Transcriptase PCR(RT-PCR)

扩增RNA序列,首先将RNA逆转录为DNA(合成cDNA第一链和第二条),后续进行正常的PCR扩增。简写为RT-PCR,注意不要和实时PCR搞混。

11、Touch down PCR

一般用于从较杂的模板中扩增目的片段,避免扩增非特异性片段,提高准确度。利用的原理是退火温度升高,引物特异性提高,引物结合难度提高,扩增效率降低。首先PCR中前几个循环的退火温度较高,保证扩增的严谨正确,然后降低温度,提高效率。要注意的是,这个方法不能根本解决扩增效率低的问题。

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