为什么要设计引物
引物是短片段的寡核苷酸，是DNA复制的起点；在生物体内可由引物酶（RNA聚合酶）生成引物（RNA短片段）；在DNA延长时，该RNA片段会被DNA片段所取代。由于DNA聚合酶需要3’羟基作为合成起点，故在体外扩增DNA序列时，仍然需要特定的引物去延伸特定的片段区域。所以为了准确的获得目标片段，引物序列的设计就非常重要!
看过一些普通PCR引物设计的资料和经验贴，整理记录在这里，方便使用！
设计引物注意事项
引物长度：引物长度为18~30个bp；太短（15bp以下）的引物结合高效，但特异性不好。长引物专一性高但退火效率会降低。
引物序列：避免编码单一、相连碱基重复（3个上述）。
避免序列互补：一条引物内的互补碱基不超过三个，否则容易形成引物二聚体。
碱基比例：GC含量40%~60%，避免AT、CG局部富集。A或T富集会使引物不稳定；C或G富集会降低退火过程时的专一性。3‘端选用G或C，但不要超过三个。G/C可以增加结合强度，但过多会降低反应专一性。
退火温度Tm：55℃
（2+4法则与GC法则的退火条件为：50nM引物、50mMNa+和pH7.0）
除上述三种Tm值计算方法外，也有其它的方法；无论哪种方法，都不能精确得出Tm值；所以，Tm值只是一个参考区间，具体操作时还应结合具体情况·进行调整。
引物保存&配制母液：
冻干粉剂可2~8℃保存；母液-20℃保存；
浓缩母液配制最好使用不含核酸酶的低浓度无菌Tris缓冲液(5-10uM，pH7-8)；
纯水虽然也可以用于配制母液，但是其pH会处于4-5，引物在该范围内不稳定；
另外，由于PCR反应需要Mg2+参与，故应避免TE缓冲液，TE中含EDTA，会结合Mg2+;
母液分装保存，可避免反复冻融。
上述经验仅针对普通PCR所需引物的设计！其它较为特殊的扩增过程需要额外的经验规则。
可以在一些网站在线设计/查找，比如
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi
https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
生工生物也提供免费设计的服务，但需要注册账号并提交订单。
除了在线网站，也可以用专业软件：Primer、Oligo、VectorNTI、Omiga
